خبر

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase substrate جو هڪ اينالاگ آهي، جيڪو انتهائي ناقابل قبول آهي.IPTG جي شموليت جي تحت، inducer ريپريسر پروٽين سان گڏ هڪ پيچيده ٺاهي سگهي ٿو، انهي ڪري ته ريپريسر پروٽين جي ٺاهه کي تبديل ڪيو ويو آهي، انهي ڪري ته اهو ٽارگيٽ جين سان گڏ نه ٿو ڪري سگهجي، ۽ ٽارگيٽ جين کي موثر طور تي ظاهر ڪيو ويو آهي.پوءِ تجربي دوران IPTG جي ڪنسنٽريشن کي ڪيئن طئي ڪيو وڃي؟ڇا وڏو آهي بهتر؟
پهرين، اچو ته IPTG انڊڪشن جي اصول کي سمجھون: E. coli جي lactose operon (عنصر) ۾ ٽي ساختياتي جينز، Z، Y، ۽ A شامل آهن، جيڪي ترتيب سان β-galactosidase، permease ۽ acetyltransferase کي انڪوڊ ڪن ٿا.lacZ hydrolyzes lactose کي گلوڪوز ۽ galactose ۾، يا allo-lactose ۾؛lacY ماحول ۾ ليڪٽوز کي سيل جھلي مان گذري ٿو ۽ سيل ۾ داخل ٿئي ٿو.lacA acetyl گروپ کي acetyl-CoA کان β-galactoside ڏانهن منتقل ڪري ٿو، جنهن ۾ زهر جي اثر کي ختم ڪرڻ شامل آهي.ان کان علاوه، هڪ آپريٽنگ تسلسل O، هڪ شروعاتي تسلسل P ۽ هڪ ريگيوليٽري جين I آهي. I جين ڪوڊ هڪ ريپريسر پروٽين آهي جيڪو آپريٽر تسلسل جي پوزيشن O سان پابند ٿي سگهي ٿو، تنهنڪري اوپيرون (ميٽا) کي دٻايو وڃي ٿو ۽ بند ڪيو.ڪيٽابولڪ جين ايڪٽيويٽ ڪندڙ پروٽين-CAP بائنڊنگ سائيٽ لاءِ پڻ هڪ بائنڊنگ سائيٽ آهي جيڪا شروعاتي تسلسل P جي اپ اسٽريم ۾ آهي. P sequence، O sequence ۽ CAP بائنڊنگ سائيٽ گڏجي لک اوپيرون جي ريگيوليٽري علائقي کي ٺاهيندا آهن.ٽن اينزايمز جي ڪوڊنگ جين کي ساڳئي ريگيوليٽري علائقي طرفان منظم ڪيو ويو آهي جين شين جي هموار اظهار کي حاصل ڪرڻ لاء.

ليڪٽوز جي غير موجودگي ۾، لاک اوپيرون (ميٽا) دٻاء جي حالت ۾ آهي.هن وقت، PI پروموٽر تسلسل جي ڪنٽرول هيٺ I تسلسل پاران ظاهر ڪيل لاک ريپريسر O تسلسل سان جڙيل آهي، جيڪو RNA پوليميرس کي P تسلسل سان پابند ٿيڻ کان روڪي ٿو ۽ ٽرانسپشن جي شروعات کي روڪي ٿو.جڏهن lactose موجود آهي، lac operon (meta) induced ڪري سگهجي ٿو هن operon (meta) سسٽم ۾، حقيقي inducer خود lactose نه آهي.ليڪٽوز سيل ۾ داخل ٿئي ٿو ۽ β-galactosidase ذريعي ڪلٽيلائز ڪيو وڃي ٿو ته جيئن allolactose ۾ تبديل ٿي وڃي.بعد ۾، هڪ inducer ماليڪيول جي طور تي، ريپريسر پروٽين سان جڙي ٿو ۽ پروٽين جي ٺاھ جوڙ کي تبديل ڪري ٿو، جيڪو ريپريسر پروٽين جي O تسلسل ۽ ٽرانسڪرپشن کان جدا ٿي وڃي ٿو.Isopropylthiogalactoside (IPTG) ساڳيو اثر آهي جيئن allolactose.اهو هڪ تمام طاقتور inducer آهي، جنهن کي بيڪٽيريا جي metabolized نه آهي ۽ تمام مستحڪم آهي، تنهنڪري ان کي وڏي پيماني تي ليبارٽريز ۾ استعمال ڪيو ويندو آهي.

IPTG جي بهترين ڪنسنٽريشن جو تعين ڪيئن ڪجي؟مثال طور E. coli وٺو.
E. coli BL21 جينياتي طور تي انجنيئر ٿيل strain جنهن ۾ مثبت recombinant pGEX (CGRP/msCT) 50μg·mL-1 Amp تي مشتمل LB مائع وچولي ۾ داخل ڪيو ويو، ۽ 37°C تي رات جو ڪلچر ڪيو ويو.مٿين ڪلچر کي 10 بوتلن ۾ 50mL تازي LB مائع وچولي ۾ داخل ڪيو ويو جنهن ۾ 50μg·mL-1 Amp جي تناسب سان 1:100 جي تناسب سان توسيع ڪلچر، ۽ جڏهن OD600 جي قيمت 0.6~ 0.8 هئي، IPTG کي فائنل ڪنسنٽريشن ۾ شامل ڪيو ويو.اهو آهي 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.ساڳئي درجه حرارت ۽ ساڳئي وقت تي شامل ٿيڻ کان پوء، بيڪٽيريا جي حل جو 1 ايم ايل ان مان ورتو ويو، ۽ بيڪٽيريا سيلز کي سينٽرفيوگريشن ذريعي گڏ ڪيو ويو ۽ SDS-PAGE جي تابع ڪيو ويو ته پروٽين جي اظهار تي مختلف IPTG ڪنسنٽريشن جي اثر جو تجزيو ڪرڻ لاء، ۽ پوء سڀ کان وڏي پروٽين جي اظهار سان IPTG ڪنسنٽريشن چونڊيو.
تجربن کان پوء، اهو معلوم ٿيندو ته IPTG جي ڪنسنٽريشن ممڪن طور تي وڏي نه آهي.اهو ئي سبب آهي ته IPTG بيڪٽيريا کي هڪ خاص زهر آهي.ڪنسنٽريشن کان وڌيڪ سيل کي به ماريندو؛۽ عام طور تي ڳالهائڻ، اسان کي اميد آهي ته سيل ۾ وڌيڪ حليل پروٽين جو اظهار ڪيو ويندو، بهتر، پر ڪيترن ئي ڪيسن ۾ جڏهن IPTG جو ڪنسنٽريشن تمام گهڻو هوندو آهي، وڏي مقدار ۾ شموليت ٺاهي ويندي.جسم، پر حل ٿيندڙ پروٽين جو مقدار گهٽجي ويو.تنهن ڪري، سڀ کان وڌيڪ مناسب IPTG ڪنسنٽريشن گهڻو ڪري وڏو نه هوندو آهي بهتر، پر گهٽ ڪنسنٽريشن.
جينياتي طور تي انجنيئر ٿيل اسٽرين کي شامل ڪرڻ ۽ پوکڻ جو مقصد ٽارگيٽ پروٽين جي پيداوار کي وڌائڻ ۽ قيمت گھٽائڻ آهي.ٽارگيٽ جين جو اظهار نه رڳو دٻاءُ جي پنهنجي عنصرن ۽ ايڪسپريشن پلازميڊ کان متاثر ٿئي ٿو، پر ٻين بيروني حالتن کان به متاثر ٿئي ٿو، جهڙوڪ انسائيڪٽر جي ڪنسنٽريشن، انڊڪشن جو گرمي پد ۽ انڊڪشن جو وقت.تنهن ڪري، عام طور تي، هڪ اڻڄاتل پروٽين کي ظاهر ڪرڻ کان اڳ ۽ صاف ڪيو وڃي، اهو بهتر آهي ته انڊڪشن جي وقت، درجه حرارت ۽ IPTG ڪنسنٽريشن جو مطالعو ڪرڻ لاء مناسب حالتن کي چونڊڻ ۽ بهترين تجرباتي نتيجا حاصل ڪرڻ لاء.